众所周知，结直肠癌是目前最常见和最致死的癌症之一，合并肝脏转移（Colorectal cancer liver metastases，CRCLM）时，患者预后会更差(1)。当前CRCLM的治疗方案效果有限，根本原因在于对CRCLM免疫微环境的研究仍不透彻。

近日，安徽医科大学附属第一医院和复旦大学华山医院的联合研究团队在The Journal for ImmunoTherapy of Cancer上发表了一项研究成果(2)，揭示了三级淋巴结构（Tertiary lymphoid structures，TLSs）的定位和丰度对CRCLM预后的重要预测价值和机制。

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该研究发现，TLSs的定位和丰度与CRCLM患者的无复发生存期（Relapse-free survival，RFS）和总生存期（Overall survival，OS）显著相关，并基于此结果建立了新的“免疫分型”系统，可有效预测CRCLM患者的预后。

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TLSs是一种在自身免疫性疾病，感染，癌症等炎症发生部位形成的淋巴聚集体(3)，其提供局部抗原呈递场所并允许效应T细胞和中央型记忆T细胞增殖和浸润，为特异性抗肿瘤反应提供重要微环境(4)，被视为癌症患者预后的预测因子。然而，TLSs对CRCLM预后的预测价值及机制尚未完全明确。

研究团队从3个癌症中心队列（安徽医科大学附属第一医院（FAH），复旦大学华山医院（HSH），同济大学第十人民医院（TPH））纳入了603名接受外科切除病灶的CRCLM患者，并收集了他们的手术切除组织标本。

病理科医生根据标本中TLSs所在的解剖区域，进行了分类和定量，并建立了以肿瘤内区域（intratumor region，T）的T分数和周围肿瘤区域（peritumor region，P）的P分数为主的TLS评分系统。

在T区域中，T分数根据其TLSs丰度进行评分：（1）分值0：区域中没有TLS；（2）分值1：有1到2个TLSs；（3）分值2：有两个以上的TLSs，但不相互融合；（4）分值3：有大量的TLSs，且相互融合。

相似地，根据P区域中的TLSs丰度进行评分（P分数）：（1）分值0：区域中没有TLS；（2）分值1：TLSs的所占面积小于50％；（3）分值2：TLSs的所占面积大于50％；（4）分值3：有大量的TLSs，且相互汇合。

进一步根据T分数和P分数分别进行分组，以比较组间RFS及OS的差异，结果发现不同区域的TLSs分数具有不同的预后价值，T分数与RFS和OS呈显著正相关（图1A），而P分数与RFS和OS呈显著负相关（图1B）。

图1. TLSs分数与CRCLM患者RFS、OS的相关性

在HSH和TPH队列中，T分数与CEA血清水平、CA19-9血清水平、肿瘤大小、肿瘤数量、肿瘤分级、T分期和淋巴结转移呈负相关，而P分数与CA19-9血清水平呈正相关。

T分数和P分数之间的不同临床病理相关性和相反的预后价值提示了T区域和P区域TLS之间的重要差异。这些数据表明，高T分数可能与免疫微环境的激活呈正相关，而高P分数则与之相反。

为了进一步探究其机制，研究团队对40例CRCLM样本进行了多重免疫组化染色（mIHC），以统计TLS内各类免疫细胞密度及比例（图2A-B）。结果发现，在T区域的TLSs中，CD4+Foxp3+Treg细胞、CD68+CD163+M2型巨噬细胞和CD4+PD-1+Tfh细胞的密度显著高于P区域的TLSs（图2C-D）。

图2. 不同区域TLSs中各类免疫细胞密度及比例

实验结果，显示T分数为1-3分的样本中肿瘤内TLSs的Treg细胞以及M2型巨噬细胞显著降低，而P分数为0-3分的样本中肿瘤内TLSs的Treg细胞以及M2型巨噬细胞显著升高（图3），表明P区域的TLS丰度及T区域的免疫抑制性微环境之间可能存在潜在关联；而在T分数为0-2的肿瘤内TLSs中Tfh细胞的比例显著升高（图3），表明在肿瘤内TLSs存在着免疫微环境正向平衡。

图3. TLSs分数与各类免疫细胞的相关性

为了进一步整合T分数和P分数对CRCLM预后的预测能力，研究者提出了一个结合了T分数和P分数的免疫分型系统：将T分数和P分数进行回归系数加权，并在HSH队列中转换为以下公式：免疫分数（RFS）=（0.52×T分数）+（-0.77×P分数），免疫分数（OS）=（0.67×T分数）+（-0.90×P分数），公式中的正系数提示为保护因素，而负系数提示为危险因素。

根据免疫分数，可以将CRCLM患者分为免疫分型I、II、III和IV类，其中在免疫分型I中的CRCLM患者，TLSs主要定位于P区域；而免疫分型IV中的患者TLSs主要定位于T区域（表1，图4）。

表1. 免疫分型系统算法

图4. 结合了T分数及P分数的免疫分型

在3个队列中，4种免疫分型的CRCLM患者存在RFS和OS显著差异（图5），其中与免疫分型I相比，免疫分型IV患者RFS和OS显著更长：免疫分型IV患者的中位RFS分别为18.5个月（HSH），48.3个月（TPH）和29.5个月（FAH），中位OS分别为26.7个月（HSH），55.6个月（TPH）和39.9个月（FAH）；免疫分型I患者的中位RFS则依次为7.9个月，13.2个月和9.0个月，中位OS分别为22.3个月，30.4个月和11.1个月。

图5. 各队列不同免疫分型的RFS、OS情况

免疫分型对RFS和OS的预测准确性指数C-index，也高于由Fong等人所提出的临床风险评分（Clinical Risk Score，CRS）(5)：免疫分型预测RFS的C-index分别为0.774（HSH）、0.760（TPH）和0.715（FAH），预测OS的C-index分别为0.801（HSH）、0.750（TPH）和0.732（FAH），均显著高于CRS（RFS：0.683、0.661和0.657；OS：0.642、0.610和0.605）。

然而这套分型系统当前仍有不足，也需要前瞻性临床研究来进一步验证其预测效力，并深入阐明导致T区域和P区域TLSs不同分布和丰度的机制，从而开发调控TLSs的细胞构成，以增强抗肿瘤免疫反应的疗法。总之，以TLSs的定位及丰度为基础的免疫分型系统，在临床实践中具有很高的预后预测潜力，有望进一步完善并用于指导精准治疗，改善CRCLM患者的预后。

参考文献：1.Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-49.

2.Zhang C, Wang XY, Zuo JL, Wang XF, Feng XW, Zhang B, et al. Localization and density of tertiary lymphoid structures associate with molecular subtype and clinical outcome in colorectal cancer liver metastases. J Immunother Cancer. 2023;11(2): e006425.

3.Engelhard VH, Rodriguez AB, Mauldin IS, Woods AN, Peske JD, Slingluff CL, Jr. Immune Cell Infiltration and Tertiary Lymphoid Structures as Determinants of Antitumor Immunity. J Immunol. 2018;200(2):432-42.

4.Calderaro J, Petitprez F, Becht E, Laurent A, Hirsch TZ, Rousseau B, et al. Intra-tumoral tertiary lymphoid structures are associated with a low risk of early recurrence of hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 2019;70(1):58-65.

5.Fong Y, Fortner J, Sun RL, Brennan MF, Blumgart LH. Clinical score for predicting recurrence after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: analysis of 1001 consecutive cases. Ann Surg. 1999;230(3):309-18; discussion 18-21.